IF 12.5 一區(qū)： 給“病毒刺客”裝上GPS：人工抗原如何照亮噬菌體

本研究開發(fā)了一種基于噬菌體的人工抗原導(dǎo)向免疫識別標(biāo)記納米平臺（Mn2+@Man-噬菌體），該平臺通過在免疫抑制微環(huán)境中搭建細(xì)菌與巨噬細(xì)胞之間的“橋梁"，介導(dǎo)免疫級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。

共價(jià)結(jié)合將甘露糖連接子[N-羥基琥珀酰亞胺-聚乙二醇-甘露糖（NHS-PEG-甘露糖）]修飾到噬菌體上（形成Man-噬菌體），并通過靜電相互作用將錳離子（Mn2?）礦化到噬菌體頭部。噬菌體憑借其固有生物學(xué)特性，對細(xì)菌具有*的靶向能力；而甘露糖功能化后，可通過多價(jià)結(jié)合與巨噬細(xì)胞表面的甘露糖受體作用，進(jìn)一步促進(jìn)免疫細(xì)胞對細(xì)菌的識別和吞噬。

為進(jìn)一步驗(yàn)證Mn2?@Man-噬菌體的表征，研究中采用TEM觀察，發(fā)現(xiàn)制備的Mn2?@Man-噬菌體與裸噬菌體具有相似的規(guī)則結(jié)構(gòu)，但形態(tài)發(fā)生改變（圖B），且頭部直徑與尾長的比例與裸噬菌體存在顯著差異。

紫外-可見（UV-Vis）光譜顯示，Man-噬菌體和Mn2?@Man-噬菌體在260nm處的吸光度升高，這源于（MnCl?）在221nm處的吸收峰以及NHS-PEG-甘露糖在227nm和266nm處的吸收峰（圖C）。

動(dòng)態(tài)光散射（DLS）測量顯示，裸噬菌體、Man-噬菌體和Mn2?@Man-噬菌體的水動(dòng)力學(xué)直徑分別為162.70±2.29nm、215.27±2.31nm和235.2±1.22nm（圖D）。相應(yīng)地，經(jīng)原位甘露糖化修飾和溫和礦化后，Mn2?@Man-噬菌體的電位較裸噬菌體有所升高，但仍整體帶負(fù)電，且在水溶液中具有良好的分散性和穩(wěn)定性（支撐材料：圖S4A、B）。

Mn2?@Man-噬菌體的元素 mappings顯示碳（C）、氧（O）和錳（Mn）呈特征性分布（圖F），與X射線能譜分析結(jié)果一致（支撐材料：圖S3C），證實(shí)Mn2?已成功礦化到Man-噬菌體頭部。通過原子力顯微鏡（AFM）進(jìn)一步表征發(fā)現(xiàn)，裸噬菌體呈現(xiàn)典型的頭-尾病毒結(jié)構(gòu)（圖G），而經(jīng)甘露糖修飾和Mn2?礦化后，Mn2?@Man-噬菌體的整體輪廓（尤其是頭部）顯著增大（圖H-J）。

通過噬菌斑計(jì)數(shù)評估工程化噬菌體的活性，發(fā)現(xiàn)Man-噬菌體和Mn2?@Man-噬菌體的滴度與裸噬菌體相當(dāng)（圖K、L），表明甘露糖化和礦化主要發(fā)生在噬菌體頭部，而噬菌體尾部的完整結(jié)構(gòu)得以保留。

考慮到Mn2?在治療系統(tǒng)中關(guān)鍵的金屬免疫調(diào)控作用，我們通過電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）評估Mn2?@Man-噬菌體中Mn2?的釋放情況：在Transwell小室外側(cè)包裹一層10kDa透析膜以建立Mn2?釋放模型（支撐材料：圖S5A）；噬菌斑實(shí)驗(yàn)證實(shí)，噬菌體無法透過透析膜而保留在上室，因此工程化噬菌體頭部釋放的Mn離子可進(jìn)入下室（支撐材料：圖S5B）。

如圖M所示，Mn2?@Man-噬菌體的Mn離子釋放具有pH響應(yīng)性——當(dāng)釋放緩沖液pH從7.0降至5.0時(shí)，Mn2?的初始爆發(fā)釋放速率顯著加快。上述數(shù)據(jù)證實(shí)，我們成功合成了基于噬菌體的免疫識別標(biāo)記納米平臺。

將Mn2?@Man-噬菌體與大腸桿菌混合孵育15分鐘后，再與RAW264.7巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)。TEM圖像顯示，Mn2?@Man-噬菌體可錨定在大腸桿菌表面（圖B），表明細(xì)菌標(biāo)記成功。此外，利用異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的Mn2?@Man-噬菌體、1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚三碳菁碘化物（DiR）染色的大腸桿菌，以及表達(dá)mCherry的RAW264.7巨噬細(xì)胞，我們通過可視化觀察發(fā)現(xiàn)，RAW264.7巨噬細(xì)胞可識別并吞噬被標(biāo)記的大腸桿菌，表明Mn2?@Man-噬菌體能在免疫細(xì)胞與病原體之間搭建“橋梁"（圖C）

流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，在Man-噬菌體介導(dǎo)下，RAW264.7巨噬細(xì)胞對大腸桿菌的吞噬活性高于裸噬菌體組（裸噬菌體組吞噬率為44.6%，Man-噬菌體組為56.3%），而Mn2?@Man-噬菌體介導(dǎo)的吞噬率最高（84.3%）（圖D、E），熒光染色和TEM圖像也證實(shí)，Mn2?@Man-噬菌體組的RAW264.7巨噬細(xì)胞吞噬作用較顯著（圖F）。

通過人工抗原評估RAW264.7巨噬細(xì)胞對被標(biāo)記細(xì)菌的殺菌能力：瓊脂平板培養(yǎng)和活/死染色結(jié)果顯示，在無巨噬細(xì)胞參與時(shí)，Mn2?@Man-噬菌體的殺菌活性與裸噬菌體相當(dāng)——與對照組相比，裸噬菌體組和Mn2?@Man-噬菌體組的細(xì)菌菌落數(shù)分別降至56.88±1.90%和57.45±4.67%（支撐材料：圖S6A-C）。

而與RAW264.7巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)后，Mn2?@Man-噬菌體介導(dǎo)的細(xì)菌存活率顯著降低（圖G）。與對照組相比，裸噬菌體組、Man-噬菌體組和Mn2?@Man-噬菌體組的胞外細(xì)菌存活率分別為43.04±5.99%、29.53±1.53%和15.04±6.71%，表明Man-噬菌體可在一定程度上介導(dǎo)巨噬細(xì)胞清除胞外細(xì)菌，而Mn2?@Man-噬菌體進(jìn)一步增強(qiáng)了這一效果。

此外，裂解細(xì)胞后收集上清液評估胞內(nèi)細(xì)菌存活率，發(fā)現(xiàn)Mn2?@Man-噬菌體組與對照組的差異較顯著，胞內(nèi)細(xì)菌存活率僅為6.18±2.26%（圖G、H）。值得注意的是，即使是噬菌體耐藥菌，經(jīng)納米平臺標(biāo)記后，仍能被RAW264.7巨噬細(xì)胞有效吞噬和殺傷（支撐材料：圖S7）。

在各類細(xì)胞群體中，巨噬細(xì)胞的優(yōu)勢亞群決定了機(jī)體抗感染免疫的方向。M1型活化巨噬細(xì)胞最初被認(rèn)為在對抗入侵病原體中起關(guān)鍵作用；而細(xì)菌長期感染會(huì)觸發(fā)巨噬細(xì)胞從促炎狀態(tài)向免疫抑制狀態(tài)（M2型表型）轉(zhuǎn)變，從而促進(jìn)感染持續(xù)發(fā)展。已有研究證實(shí)，錳（Mn2?）等營養(yǎng)金屬離子可激活環(huán)磷酸鳥苷-腺苷合成酶-干擾素基因刺激因子（cGAS-STING）通路，增強(qiáng)免疫效能。

利用Mn2?釋放模型，分析RAW264.7巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)：將M0型和M2型RAW264.7巨噬細(xì)胞分別在Mn2?釋放模型的下室培養(yǎng)24小時(shí)。

流式細(xì)胞術(shù)分析證實(shí)，Mn2?@Man-噬菌體釋放的Mn2?顯著提高了M0型RAW264.7巨噬細(xì)胞中M1/M2標(biāo)志物（CD86/CD206、iNOS/Arg-1）的比值。

同時(shí)，Mn2?@Man-噬菌體組的M2型RAW264.7巨噬細(xì)胞被有效重編程為殺菌表型：CD86?和iNOS?巨噬細(xì)胞比例分別從31.7%和3.56%升至53.2%和24.7%，而CD206?和Arg-1?巨噬細(xì)胞比例分別從82.8%和21.2%降至43.2%和10.4%（圖D、E）。

深入探究Mn2?@Man-噬菌體誘導(dǎo)的基因組變化，采用RNA測序分析其轉(zhuǎn)錄組圖譜。

火山圖顯示，Mn2?@Man-噬菌體處理后共鑒定出2200多個(gè)差異表達(dá)基因（DEG），且這些基因主要參與促炎應(yīng)答（圖A）。KEGG富集分析顯示，Mn2?@Man-噬菌體處理后，免疫相關(guān)激活通路中候選基因的富集因子變化較為顯著，包括IL-17、TNF、NF-κB和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（NOD）樣信號通路（圖5B）?；蚣患治觯℅SEA）結(jié)果與之一致，進(jìn)一步證實(shí)RAW264.7巨噬細(xì)胞對病原體的激活效應(yīng)（圖C）。

轉(zhuǎn)錄圖譜熱圖顯示，Mn2?@Man-噬菌體處理后，巨噬細(xì)胞中免疫激活相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，包括抗原呈遞共刺激分子（如CD40、CD80、CD86、Icosl）和促炎細(xì)胞因子（如IL-6、IL-1β、Nos2、TNF-α、IL-12）的轉(zhuǎn)錄水平廣泛升高（圖D）。此外，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）檢測也發(fā)現(xiàn)，促炎基因（Tnfa、Il1b、Nos2）的表達(dá)呈顯著上調(diào)趨勢（圖E）。

此外，基因本體論（GO）數(shù)據(jù)庫分析顯示，上調(diào)基因與巨噬細(xì)胞表型和金屬離子結(jié)合相關(guān)——生物學(xué)過程和分子功能的頂級富集術(shù)語包括巨噬細(xì)胞激活、促炎應(yīng)答、Mn2?結(jié)合以及免疫應(yīng)答相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生（圖F）。

為探究Mn2?@Man-噬菌體的感染靶向潛力，在單只小鼠上進(jìn)行了對比建模實(shí)驗(yàn)：右側(cè)脛骨植入無菌物體，左側(cè)脛骨植入被大腸桿菌污染的植入物（圖A）。大腸桿菌感染24小時(shí)后，向小鼠靜脈注射裸噬菌體和Mn2?@Man-噬菌體，并利用活體熒光成像系統(tǒng)（IVIS）檢測其分布。

如圖B、C所示，注射后2小時(shí)即可在感染脛骨處觀察到熒光信號，且信號強(qiáng)度隨時(shí)間逐漸增強(qiáng)，在注射后12小時(shí)達(dá)到峰值；而未感染部位的熒光信號無顯著變化。這些結(jié)果表明，Mn2?@Man-噬菌體可精準(zhǔn)結(jié)合大腸桿菌，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)菌清除和免疫調(diào)控。

此外，我們評估了Mn2?@Man-噬菌體的治療效果（圖D）。治療后第7天，接受Mn2?@Man-噬菌體治療的小鼠感染嚴(yán)重程度顯著減輕：蘇木精-伊紅（H&E）染色和吉姆薩染色顯示，骨髓中中性粒細(xì)胞浸潤和細(xì)菌載量顯著降低（圖E）；掃描電子顯微鏡（SEM）結(jié)果顯示，Mn2?@Man-噬菌體組植入物上的細(xì)菌菌落被顯著清除（圖E）。

同時(shí)，膝關(guān)節(jié)腫脹減輕、膝關(guān)節(jié)周長縮小、體重恢復(fù)以及組織學(xué)評分降低，均表明Mn2?@Man-噬菌體具有優(yōu)異的抗菌效果（圖F-I）。

瓊脂平板培養(yǎng)結(jié)果與上述一致：Mn2?@Man-噬菌體處理后，骨髓和植入物中的細(xì)菌菌落數(shù)均大幅減少。與對照組相比，Mn2?@Man-噬菌體組骨髓和植入物中的細(xì)菌計(jì)數(shù)均降低6個(gè)數(shù)量級，而裸噬菌體組僅降低4個(gè)數(shù)量級（圖J）。

免疫熒光染色圖像顯示，Mn2?@Man-噬菌體可介導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1型極化，表現(xiàn)為CD86和iNOS表達(dá)升高（圖B、C）。

M1型極化巨噬細(xì)胞在宿主抗感染防御中起重要作用：它們遷移至感染部位后，識別并吞噬入侵細(xì)菌，隨后發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，并向適應(yīng)性免疫細(xì)胞呈遞抗原。同時(shí)，CD4?和CD8?T細(xì)胞的級聯(lián)激活需要M1型巨噬細(xì)胞提供充足的抗原呈遞。

Mn2?@Man-噬菌體治療后，免疫組化染色顯示骨髓中CD4?和CD8?T細(xì)胞浸潤增加，表明Mn2?@Man-噬菌體激活的巨噬細(xì)胞可通過吞噬細(xì)菌并向T細(xì)胞呈遞抗原，促進(jìn)T細(xì)胞激活（圖D、E）。

本研究基于噬菌體捕食的固有機(jī)制，提出了一種創(chuàng)新的抗細(xì)菌感染噬菌體免疫療法——該療法通過在宿主免疫抑制微環(huán)境中重建細(xì)菌與巨噬細(xì)胞之間的“橋梁"，介導(dǎo)抗感染免疫級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。所有數(shù)據(jù)均證實(shí)，我們的納米平臺可有效激活免疫應(yīng)答，實(shí)現(xiàn)細(xì)菌清除。此外，研究結(jié)果表明，經(jīng)修飾的噬菌體可作為細(xì)菌表面的“人工抗原"，用于宿主細(xì)胞免疫監(jiān)視；且該治療系統(tǒng)可擴(kuò)展應(yīng)用于多種免疫細(xì)胞和病原體。

鑒于傳統(tǒng)抗生素替代方案的迫切需求，本策略通過整合免疫治療特性，為噬菌體療法帶來創(chuàng)新，為其在臨床感染治療中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

機(jī)制創(chuàng)新：揭示噬菌體單獨(dú)療法的局限：不能有效激活宿主免疫，導(dǎo)致耐藥菌和免疫抑制環(huán)境持續(xù)存在。提出通過“人工抗原標(biāo)記"重建細(xì)菌與免疫系統(tǒng)的連接。

材料策略創(chuàng)新：將噬菌體殘留衣殼“二次利用"為人工免疫標(biāo)記載體。引入 甘露糖+Mn2? 雙功能化：甘露糖增強(qiáng)巨噬細(xì)胞受體識別。Mn2?作為免疫金屬因子，觸發(fā) cGAS-STING 信號，推動(dòng) M1 極化。

治療模式創(chuàng)新：不再僅依賴噬菌體直接裂解，而是通過“噬菌體-宿主免疫雙橋梁"實(shí)現(xiàn)細(xì)菌清除。同時(shí)激活 先天免疫（巨噬細(xì)胞）+ 適應(yīng)性免疫（T細(xì)胞），構(gòu)建系統(tǒng)性免疫反應(yīng)。

該策略可適配多種噬菌體，不限于單一病原體，甚至可與噬菌體雞尾酒聯(lián)合?？山玉g不同免疫配體，具備較高的可擴(kuò)展性與轉(zhuǎn)化潛力。