分子互作實(shí)驗(yàn)RIP（RNA免疫沉淀）

一、技術(shù)簡(jiǎn)介

RIP（RNA Immunoprecipitation，RNA免疫沉淀）技術(shù)是一種用于研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白質(zhì)相互作用的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)方法，能夠揭示RNA結(jié)合蛋白（RBP）在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中的功能機(jī)制。

二、技術(shù)原理

RIP利用針對(duì)目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來(lái)，通過(guò)分離純化，對(duì)結(jié)合在復(fù)合物上的RNA 進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證或測(cè)序分析，結(jié)果更具生物學(xué)說(shuō)服力。

三、應(yīng)用場(chǎng)景

1.基礎(chǔ)機(jī)制：解析RNA結(jié)合蛋白（如AGO2、Polycomb復(fù)合物）的功能及RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2.疾病研究：比較疾病與正常樣本中RNA-蛋白互作差異，發(fā)現(xiàn)潛在生物標(biāo)志物（如癌癥相關(guān)lncRNA）。

3.藥物開(kāi)發(fā)：評(píng)估藥物對(duì)RNA-蛋白互作的影響，加速靶點(diǎn)篩選。

四、技術(shù)優(yōu)勢(shì)

1.靈敏度較高：可檢測(cè)低豐度RNA與蛋白的微弱相互作用。

2.動(dòng)態(tài)范圍廣：從少量細(xì)胞（如5×10?個(gè)）到復(fù)雜組織樣本均適用。

3.多組學(xué)聯(lián)用：結(jié)合RNA-Seq、CLIP-Seq或ChIP-Seq，構(gòu)建多維調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

五、樣本類型

新鮮細(xì)胞（貼壁細(xì)胞/懸浮細(xì)胞）、凍存細(xì)胞、凍存組織、交聯(lián)后細(xì)胞樣本。

六、樣本需求

細(xì)胞樣本：約1×10^7個(gè)（可以是1個(gè)10cm皿，或以懸浮細(xì)胞形式存儲(chǔ)于離心管中，或1個(gè)T75瓶）；

凍存組織：約70mg；交聯(lián)細(xì)胞樣本：使用1%甲醛交聯(lián)處理細(xì)胞。

七、樣本準(zhǔn)備&運(yùn)輸

活細(xì)胞樣本：距離較近的可以將養(yǎng)在皿/T75瓶/離心管內(nèi)的新鮮細(xì)胞樣本常溫快遞（最遲次日達(dá)）運(yùn)輸，本市內(nèi)可閃送或親自遞送，距離較遠(yuǎn)的，可-80℃凍存細(xì)胞干冰運(yùn)輸；

組織樣本&交聯(lián)后細(xì)胞樣本：-80℃凍存干冰運(yùn)輸。

八、需提供的試劑

檢測(cè)用ChIP級(jí)抗體。

九、實(shí)驗(yàn)周期

1-2周（不包含測(cè)序）

十、其他

后續(xù)檢測(cè)選擇RT PCR時(shí)，需提供后續(xù)檢測(cè)的位點(diǎn)。

甲醛交聯(lián)細(xì)胞具體步驟：①在細(xì)胞皿中加入終濃度為1%的甲醛，37℃孵育10分鐘；②使用含[1mM PMSF，1μg/ml抑肽酶和1μg/ml pepstatin A]的冰冷DPBS洗滌細(xì)胞兩次。③將細(xì)胞刮入含有蛋白酶抑制劑的2ml冰冷的DPBS中，并轉(zhuǎn)移到離心管中，凍存寄送。